1 ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации
В настоящее время в клинической лабораторной диагностике широко используются современные биохимические и иммунохимические методы. С целью совершенствования и ускорения проведения исследований применяются полуавто- и автоанализаторы, а так же большое количество лабораторно-диагностических наборов и тест-систем.
Биохимический анализатор – это прибор для биохимических исследований различных веществ: электролитов, ферментов, гормонов и прочее. Он способен определить концентрацию и наличие этих веществ практически в любых видах биологического материала. Биохимический анализатор обеспечивает выполнение различных тестов и анализов: от срочных до традиционных клинико-биохимических.
Данные аппараты делят на автоматические и полуавтоматические. Автоматические выполняют большой спектр операций: отбор материалов и реагентов, их смешивание и нагрев, анализ, обработка и печать полученной информации, автоматическое промывание прибора. Исследования с использованием биохимических анализаторов являются более быстрыми и точными по сравнению с ручными методами.
Mindray BS-200E Калибровка и контроль качества
К ценным достоинствам современных анализаторов относится высокий уровень стандартизации процесса, постоянство количества и химического состава расходных материалов. Применение идентичных реагентов и реактивов способствует сопоставимости результатов, полученных в разное время в разных лабораториях. В данной статье раскрывается актуальность использования современных биохимических анализаторов и основные принципы их работы.
биохимические анализаторы
клиническая диагностика
автоматический биохимический анализатор
спектрофотометры
1. Скворцова Р.Г. Современные подходы к организации клинико-диагностической лаборатории // Сибирский медицинский журнал. – 2013. – № 6. – С. 170–174.
2. Судаков И.А., Сахабиева Э.В. Биохимический анализатор как инструмент современной медицинской диагностики // Аллея науки. – 2018. – № 6(22). – С. 396–399.
3. Майорова К.В., Газизов Р.А. Принцип выбора биохимического анализатора для клинической лаборатории // Динамика взаимоотношений различных областей науки в современных условиях. – Уфа: Общество с ограниченной ответственностью «ОМЕГА САЙНС», 2017. – С. 44–47.
4. Sadiqov R.V. Тhe value of immunological and biochemical analyses in carrying out medical and biology researches // Anzbajndan Medical Journal. – 2012. – № 2. – С. 155–158.
5. Spasov A.A., Bugaeva L.I., Bukatin M.V., Kuzubova E.A., Rebrova D.N. The influence of a new antioxidatic preparation on the reproductive function of male-rats // European Journal of Natural History. – 2007. – № 1. – С. 115–116.
Биохимические анализаторы являются важным и необходимым шагом в развитии современных клинико-биохимических исследований. Диагностические исследования, проводимые с непосредственным участием лаборанта, могут значительно отклоняться от действительности из-за неизбежных ошибок при работе с большим числом образцов. Исследования с использованием анализаторов отличаются от стандартных ручных методов высокой надёжностью, большей точностью, экономичностью и эффективностью, что обеспечивает возможность быстрой постановки правильного диагноза [1].
Доклад от ФГБУ ЦНМВЛ о реагентах «ДиаВетТест»
Первым толчком к развитию биохимических анализаторов послужило создание фотометров и спектрофотометров с контролируемой температурой кюветы. Это позволило осуществить на практике принцип кинетического исследования субстратов и ферментов. В дальнейшем в устройства была заложена электронная функция автоматического перевода регистрируемых значений в показатели концентрации или активности. Исключение из процесса оператора позволило проводить исследования в режимах:
• фиксированного времени (измерение результата через определенный интервал времени после начала реакции);
• кинетики (ряд измерений с определенным интервалом времени и расчетом активности фермента по средней величине изменения абсорбции за этот интервал времени);
• дифференциальном (расчет концентрации по разности абсорбции опытного и контрольного образцов);
• бихроматическом (расчет концентрации по разности абсорбции, измеренной на двух длинах волн).
Важную роль играет качество исполнения самого анализатора, неразрывно связанное как со стоимостью прибора, так и его обслуживания. Анализаторы «закрытого» типа имеют наиболее высокую точность измерения, но только при использовании в них предписанных производителем реагентов. Анализаторы «открытой» системы предоставляют возможность использования реагентов любых производителей, но при этом, ни изготовитель анализатора, ни изготовитель реагентов не дает гарантий получения корректных результатов для каждого конкретного варианта совмещения анализатора и реагентов.
Биохимический анализатор может обеспечивать выполнение различных тестов и анализов: от срочных до традиционных клинико-биохимических. Данные аппараты делят на автоматические, полуавтоматические и спектрофотометры. Автоматические выполняют большой спектр операций: отбор материалов и реагентов, их смешивание и нагрев, анализ, обработку и печать полученной информации, автоматическое промывание прибора. На полуавтоматических анализаторах процесс подготовки анализируемых веществ оператор производит вручную, что крайне неудобно для крупных лабораторий. Для более быстрой и удобной работы системы биохимические анализаторы могут быть оснащены: автоматическими манипуляторами, центрифугами для пробирок, специальным программным обеспечением для обработки результатов пациентов.
Полуавтоматические биохимические анализаторы осуществляют автоматическую калибровку, выдают запрос о необходимости добавления последующей пробы. Вычисление результатов исследования происходит по выбранному оператором алгоритму и отображается на дисплее прибора.
В некоторых модификациях приборов предусмотрены дополнительные опции, позволяющие производить сравнения результатов и определить их соответствие по бланку, изменению оптической плотности или значению. Возможно несколько вариантов предоставления информации: в электронном виде (вывод результатов на экране монитора либо сохранение на записывающем устройстве), печать на бумаге. При использовании полуавтоматического анализатора лаборанту необходимо самостоятельно приготовить пробу и подготовить реагент. Полуавтоматический биохимический анализатор используется в «малых» лабораториях с производительностью до 200 тестов/час.
Автоматические биохимические анализаторы требуют крайне малого участия оператора. Оператор подбирает профиль работы прибора по аналогии с порядком установления параметров и количеством анализируемых проб.
Контроль оператора нужен только на фазе программирования тестов и при определении «профиля» (регламента последовательности определения тех или иных параметров) и числа анализируемых проб. Все остальные действия по подготовке пробы осуществляются в автоматическом режиме. Основными качествами всех автоматических биохимических анализаторов являются: большая пропускная способность, малый (в сравнении с мануальными методиками и определением на полуавтоматических анализаторах) расход реагента, автоматическая подача и смешивание реагентов (в наиболее современных системах блок для хранения реагентов охлаждается). Большее количество автоматических системы оборудованы программным обеспечением, позволяющим оценивать точность результатов, кроме того, при получении неточного результата они позволяют повторить анализ с другим разведением пробы. Практически во всех приборах этого класса управление осуществляется при помощи внешнего компьютера или аналогичного современным компьютерным системам встроенного процессора [1, 2].
По работе с реагентами полностью автоматизированные анализаторы принято делить на так называемые «открытые» и «закрытые» системы.
Закрытый тип анализаторов предполагает применение ограниченного числа реагентов, предусмотренных разработчиком. В систему изначально добавлены контрольные и калибровочные данные, а информация о применяемых реагентах в данном конкретном исследовании заносится в прибор посредством считывания штрих-кода с их упаковки. Ограниченность выбора реагентов является минусом данного анализатора. Как правило, заявленные производителем реагенты достаточно дорогостоящие, заменить их более дешевыми аналогами нельзя, так как это может привести к некорректной работе самого анализатора. К плюсам анализатора данного типа можно отнести стабильность результатов калибрования.
Открытый тип анализаторов предполагает возможность применения реагентов практически любого производителя благодаря встроенному набору светофильтров для выполнения наиболее распространенных методик анализа. В целом работа систем открытого и закрытого типа одинакова. Стоит отметить, что не все системы открытого типа полностью похожи. Каждый производитель разрабатывает свои уникальные механизмы – блоки реагентов, блоки анализируемых образцов и т. д.
В основу работы лабораторного анализатора положен спектрофотометрический метод – изучение биологических жидкостей с помощью химических реакций и спектральных измерений. Точность, объективность анализов в сочетании с высокой производительностью – основные достоинства этого метода.
Автоматические биохимические анализаторы проводят весь процесс работы без вмешательств лаборанта: дозировку проб и реагентов; фотометрию, выведение данных на монитор компьютера и их перенесение на бумагу; промыв системы тоже происходит автоматически [2].
Из этого следует, что автоматические биохимические анализаторы выгодно отличаются от остальных типов: своей производительностью до 800 тестов/час; скоростью замера и обработки результатов: время одного замера составляет от 3 до 30 сек; минимальным расходом реагентов; точностью результатов.
Плюсы использования автоматического биохимического анализатора:
1. Требуют минимального участия оператора. Оператор выбирает профиль работы прибора в соответствии с порядком определения параметров и количеством анализируемых проб. Все остальные действия по подготовке пробы осуществляются в автоматическом режиме.
2. Высокая производительность, быстрота в обработке проб и результатов анализов.
3. Экономическая выгодность и быстрая окупаемость за счет минимального потребления реагентов, исследуемых материалов, электроэнергии за счёт автоматического смешивания, подачи реагентов и промывки системы.
4. Управление автоматическим биохимическим анализатором осуществляется посредством самого современного компьютерного оборудования, которое в зависимости от модели может являться неотъемлемой частью прибора, либо анализатор имеет возможность подключения к внешнему мощному компьютеру. Программное обеспечение адаптировано под работу с операционными системами Windows и DOS [3].
Методы спектрофотометрии основаны на том, что своими, характерными только для него, спектральными свойствами, обладает каждое вещество. Спектрофотометр- прибор, предназначенный для измерения отношений двух потоков оптического излучения, один из которых – поток, падающий на исследуемый образец, другой – поток, испытавший то или иное взаимодействие с образцом.
Позволяет производить измерения для различных длин волн оптического излучения, соответственно в результате измерений получается спектр отношений потоков. Обычно используется для измерения спектров пропускания или спектров отражения излучения.
Спектрофотометры, предусмотрены на регистрацию величины оптической плотности и производящие элементарные математические операции с полученными величинами, которые, в свою очередь, подразделяются на одно- и многоканальные системы. Между собой они отличаются по наличию (или отсутствию) ряда вспомогательных возможностей, таких как термостатирование пробы, автоматический вычет бланка, вывод результатов на дисплей или на печатную ленту и так далее. Приготовление реагентов, смешивание и внесение образцов, порядок очередности тестов для всех этих анализаторов проводится врачом-лаборантом вручную, поэтому используемые в этом случае методики называют «ручными» или «мануальными». С помощью спектрофотометра определяют состав и наличие примесей в различных жидкостях, таких как медицинские растворы, вода, продукты нефтяной и химической промышленности, продукция лакокрасочного производства [1, 4].
Все методы биохимического анализа имеют чёткие правила, выполнение которых позволяет определить правильный диагноз и увеличить производительность, что немаловажно. К ним относится правило минимального объема проб, которое позволяет повысить экономичность биохимического анализатора в целом.
Кроме того, существует такой нюанс работы рассматриваемых приборов, как минимальный шаг дозирования, который также способен оказывать серьезное влияние на расход реагентов, а значит и экономическую эффективность анализатора. Более точная (с меньшим шагом) дозировка реагентов и образцов позволяет выдержать заданный регламент анализа, используя меньшее количество препаратов. В автоматизированных анализаторах присутствует проточная кювета, исключившая ошибки, связанные с постановкой кюветы в измерительный модуль и ее термостатированием, и позволяющей экономнее расходовать реактивы, поскольку при толщине поглощающего слоя 1 см объем кюветы составляет не более 100 мкл. С учетом объемов подводящих трубок и необходимости несколько раз менять реакционную смесь в кювете до начала измерения объем раствора, требуемый для проведения измерений, составляет 0,5–1,0 мл [4].
Принцип действия биохимического анализатора – с двух сторон отверстия находятся два независимых друг от друга электрода, когда клетка проходит через апертуру, появляется электрический импульс, регистрируемый специальным датчиком. Для установления степени концентрации тестируемых клеток через апертуру прогоняют через канал нужный объем пробы и производят подсчет образованных при этом импульсов.
В некоторых случаях при подсчете импульсов осуществляется сбой и устройство выдает ошибочный результат. Это происходит, например, когда в одно и то же время в апертуре находится сразу две клетки. В этом случае анализатор фиксирует их как один электрический импульс.
Чтобы не совершить подобной ошибки, делают разведение тестируемой пробы при помощи изотонического раствора определенной концентрации. Это позволяет достигнуть присутствия в канале устройства в нужный момент только одной клетки. Тем не менее, при недостаточном перемешивании дозы крови перед тестированием ошибка не исключается даже при верном разведении пробы. Данные анализа, выдаются в виде цифровых значений и дополнительного графического изображения.
Практически все современные анализаторы могут проводить исследования по конечной точке, а также регистрировать динамику фермент-субстратного взаимодействия, точно определять другие параметры, используя изначально заложенные или составленные в ходе исследования калибровочные кривые [5].
Помимо этого, некоторые модели анализирующих устройств открытого типа также оборудованы сканером штрих-кода, что позволяет таким же образом считывать информацию об используемых реагентах.
Таким образом, биохимический анализатор остается наиболее востребованной и неотъемлемой частью не только современной клиники, но экспериментальной биологической лаборатории.
Вывод: биохимические анализаторы абсолютно необходимы при проведении клинической диагностики, поскольку эффективность их работы в разы превышает эффективность диагностики, проводимой вручную. Стоит отметить такие моменты, как качество самих анализаторов, которое может значительно варьировать, связанную с качеством оборудования стоимость и необходимость правильного обслуживания аппаратуры. Эти критерии выступают как ограничители, препятствующие распространению как высококачественных анализаторов, так и аппаратуры такого рода в принципе. Опыт применения типовых анализаторов для лабораторий показал, что их введение имеет положительное значение, но зачастую эффективность оказывается ниже необходимого. Следовательно, выбор анализатора должен производиться с учётом специфики самого медицинского или исследовательского учреждения, а также условий, влияющих на его работу.
Источник: science-pedagogy.ru
Фотометрия в лабораторной диагностике
Фотометрия — это широко используемый метод в лабораторной диагностике. Большинство показателей исследуемых в разделе «биохимия» измеряется при помощи фотометрии. Помимо биохимии фотометрия используется в ИФА, общем анализе мочи и крови и т.д.
В дальнейшем, для простоты в статье будет рассматриваться только горизонтальная фотометрия в проходящем свете (то есть измерение оптической плотности растворов).
Итак, все начинается с простейшей схемы прибора, который используется для фотометрической детекции.
В простейшем случае световой поток от источника света налетает на исследуемый раствор. После прохождения через раствор ослабленный световой поток попадает на фотодетектор. Поскольку условия, при которых проводится измерение подбираются так, что вся оптическая плотность раствора обусловлена присутствием одного вещества, то измеряя оптическую плотность мы можем, в конечном итоге, определять концентрацию этого вещества.
Физические основы фотометрии
Физический принцип, лежащий в основе данного процесса, называется законом Бугера-Ламберта-Берра.
I = I 0 10 — e λ c l
- I — интенсивность света прошедшего через раствор
- I0 — исходная интенсивность падающего на кювету с раствором света (ее можно измерить, просто убрав кювету с раствором так, чтобы свет от источника непосредственно падал на фотодетектор)
- c — концентрация поглощающего вещества в растворе (ммоль/л)
- l — толщина поглощающего слоя (см)
- eλ — молярный коэффициент поглощения (л×моль -1 ×см -1 ) величина индивидуальная для каждого вещества при определенной длине волны
Таким образом, если принять, что в условиях измерения которые мы можем стандартизировать величина eλ известна, толщина поглощающего слоя известна и вообще то определяется нами, величины I и I0 выясняются в процессе измерения, следовательно зная все эти показатели в конечном счете можно вычислить концентрацию исследуемого вещества.
Прологарифмировав нашу исходную формулу по основанию 10, получим:
lg I = lg I 0 — e λ c l
Далее путем нехитрых преобразований получаем:
lg I 0 I = e λ c l
Величина lg I0/I называется оптической плотностью и как правило обозначается буквами A или D или OD. Поскольку величины eλ и l являются постоянными при каждом измерении, то оптическая плотность линейно зависит только от концентрации измеряемого вещества в растворе, следовательно измеряя оптическую плотность мы можем определить концентрацию.
Проведение калибровки
Как уже было сказано выше оптическая плотность и концентрация определяемого вещества связаны линейной зависимостью.
Отсюда следует, что, зная уравнение прямой для данной зависимости мы можем по любой известной оптической плотности узнать концентрацию интересующего нас вещества.
Для того, чтобы узнать это уравнения проводится процедура калибровки.
На практике если калибровка делается вручную процедура заключается в построении так называемой калибровочной кривой (которая в случае фотометрического измерения чаще всего является прямой линией :).
Для построения линейной зависимости требуется как минимум две точки.
Для начала берется раствор с известной концентрацией вещества (калибратор), которое мы собираемся измерять. После проведения соответствующей химической реакции измеряется оптическая плотность получившейся реакционной смеси, при этом на графике по оси абсцисс откладывается концентрация вещества в растворе, а по оси ординат получившаяся оптическая плотность. Таким образом мы получаем первую точку на графике. Для получения второй точки можно использовать раствор с другой концентрацией, но на практике исходят из предположения, что раствор с нулевой концентрацией обладает нулевой оптической плотностью и в качестве второй точки просто берется начало координат (на самом деле это не так, но это преодолевается при помощи специальных процедур настройки прибора), что позволяет проводить калибровку большинства показателей биохимии по калибратору только с одним уровнем концентрации.
Таким образом получается график, используя который, можно по известной оптической плотности определить концентрацию вещества в растворе.
В современный лабораториях калибровку как правило вручную не проводят, это делается автоматически биохимическими анализаторами или другими приборами с фотометрической детекцией на борту.
Суть остается той же за исключением того, что прибор делает расчет для нахождения функции, описывающей калибровочный график, и далее использует ее для расчета концентраций. Калибровочный график при этом строится исключительно для удобства пользователя.
В общем виде функция, описывающая прямую линию, выглядит следующим образом:
- y — оптическая плотность
- x — концентрация исследуемого вещества
- a — тангенс угла наклона нашей прямой (фактор калибровки)
- b — оптическая плотность при нулевой концентрации, как правило равна нулю
Поскольку значение b при помощи настроек прибора приводится к значению ноль, то вся процедура калибровки сводится к нахождению фактора калибровки, при умножении на него оптической плотности анализатор в дальнейшем вычисляет все концентрации интересующего нас вещества.
Выбор длинны волны
При проведении фотометрического измерения источник света как правило генерирует световой поток по всему видимому (и не только) спектру длин волн. Источники света современных биохимических анализаторов как правило охватывают диапазон от ближнего ультрафиолета и до всего видимого красного диапазона.
Как уже говорилось ранее молярный коэффициент поглощения является функцией от длинны волны и следовательно исследуемый раствор будет обладать разными коэффициентами поглощения на разных длинах волн. При этом на практике, в основном для того, чтобы избежать влияния неспецифических факторов, измерения проводится на какой-то одной определенной длине волны.
Для выбора длины волны на заре лабораторной диагностики существовало такое наивное эмпирическое правило: если мы видим, что раствор окрашен в какой-либо цвет, то нужно выбрать для измерения длину волны по цвету, отличающуюся от цвета раствора.
Помимо того, что данный подход слишком упрощен, он еще и не применим к ультрафиолетовой части спектра.
Более научный подход заключается в построении графика зависимости оптической плотности раствора от длинны волны.
Поскольку измеряемые биохимическими методами биологические вещества, как правило не обладают достаточной собственной оптической плотностью, для их детекции используются различные специфические химические реакции, которые в итоге и генерируют вещества обладающие достаточной оптической плотностью, в этом случае говорят, что реакция идет с увеличением оптической плотности. Либо в процессе реакции такие вещества расходуются, тогда реакция идет с уменьшением оптической плотности.
Для выбора длинны волны для конкретного метода проводится построение двух графиков зависимости оптической плотности раствора от длинны волны:
- для субстрата (субстратов) химической реакции
- и для продуктов (продукта) химической реакции
После построения графика берется длинна волны, на которой разность оптической плотности у субстратов и продуктов реакции максимальна.
Для примера можно взять так называемый оптический тест Варбурга.
Данная реакция широко используется как индикаторная многими производителями для определения ЛДГ, АЛТ, АСТ, КФК, КФК-МБ, мочевины и глюкозы (гексокиназным методом).
Данная реакция заключается в обратимом окислении никотинамидадениндинуклеотида (НАД) под действием какого-нибудь фермента из класса оксидоредуктаз.
В результате мы имеем два графика для окисленной и восстановленной формы НАД одна из которых играет роль субстрата, а другая продукта реакции в конкретных биохимических наборах.
В результате анализа данного графика видим, что наибольшая разница оптической плотности между этими двумя формами находится в районе 340 нм. Именно эта длинна волны и используется для определения перечисленных выше биохимических показателей.
Устройство, которое преобразует свет от источника в световой поток с какой-то одной определенной длинной волны называется монохроматор.
Основные типы монохроматоров:
- Абсорбционный светофильтр — самый первый монохроматор, по большому счету представляющий из себя просто цветное стеклышко
- Дифракционный светофильтр
- Призма
- Дифракционная решетка — в настоящее время у большинства лучших биохимических анализаторов монохроматор представляет из себя голографическую дифракционную решетку
Таким образом, если включить в нашу схему простейшего фотометра монохроматор (например призму), то она будет выглядеть следующим образом.
Бихроматическое измерение
В лабораторной диагностике зачастую возникают ситуации, когда нужно провести измерение оптической плотности на двух длинах волн. Такие измерения называются бихроматическими.
Теоретическое обоснование проведения такого измерения следующее: в биологических жидкостях присутствует огромное количество различных веществ, некоторые из которых могут обладать собственной оптической плотностью или вступать в неспецифические реакции с компонентами диагностический наборов, при этом зачастую биологические жидкости могут проявлять свойства коллоидных растворов и не только поглощать, но и рассеивать свет. Поэтому для того, чтобы учесть влияние этих интерферирующих факторов оптическая плотность рассчитывается как разность между оптической плотностью на основной длине волны (о ней уже шла речь выше) и другой длине волны, которая обычно называется опорной или отсекающей, оптическая плотность на которой, как считается, обусловлена неспецифическими факторами.
Приведенная в предыдущем разделе конструктивная схема фотометра называется монохроматической. Исторически она возникла первой, но в современных машинах практически не используется.
Монохроматической она называется потому, что в каждый конкретный момент времени считывание оптической плотности проводится только на одной длине волны и для того, чтобы провести бихроматическое измерение нужно, например, физически поменять светофильтр или изменить угол поворота призмы или дифракционной решетки. В некоторых вариантах проведения фотометрии это неприемлемо (например, кинетические измерения). Поэтому в дальнейшем была разработана полихроматическая схема детекции, которая позволяет считывать оптическую плотность раствора на нескольких длинах волн. Этого было достигнуто разложением полихроматического света в спектр уже после прохождения через поглощающий раствор (то есть перенесением монохроматора за кювету с образцом) и установкой сразу нескольких фотодетекторов для разных длин волн.
Такая схема позволяет проводить измерение на нескольких длинах волн одновременно.
Методы расчета концентрации
Существует несколько способов расчета концентрации раствора по полученной оптической плотности.
Наиболее простым является метод расчета по конечной точке.
При таком методе график зависимости оптической плотности от концентрации измеряемого вещества выглядит следующим образом:
При этом после небольшого времени задержки (lag-time), связанного с перемешиванием биоматериала с компонентами диагностического набора и их термостатированием происходит резкое возрастание оптической плотности до определенного уровня, пропорционального концентрации определяемого вещества, после выхода оптической плотности на «плато» дальше она уже практически не изменяется (достигает конечной точки).
Методы измерения в клинической биохимии
Все измерения в клинической биохимии (как собственно и во всех других областях) выполняются прямым либо косвенным методом.
В первом случае проводится прямое измерение заданных аналитов.
При косвенном методе измеряется одна величина и пересчитывается в другую. При этом измеряемая величина должна иметь функциональную зависимость от рассчитываемой.
Для прямых измерений используются специальные датчики (или чипы), которые реагируют только на наличие того вещества, для поиска которых они созданы. Это могут быть ионоселективные датчики, датчики глюкозы, лактата, pH, датчики газов. Прямой метод является весьма точным и дешевым способом измерения. Однако, его недостаток состоит в том, что прибор, созданный для измерения какого-либо одного аналита не сможет измерять концентрацию других веществ, что сужает применение приборов данного типа. Для измерения концентрации, скажем, 30-40 веществ (а обычно столько методик и выполняют в лабораториях), необходимо столько же приборов.
Универсальность измерений обеспечивается устройствами, использующими косвенный метод измерения. К таким относятся программируемые и автоматические фотометры. В этом типе приборов реализован принцип фотометрирования, при котором регистрируют оптическую плотность и ее изменения.
Измерение концентрации белков, микроэлементов, ферментов, гормонов в биологических жидкостях осуществляется с использованием специальных наборов реагентов, при взаимодействии которых с соответствующими аналитами происходит измерение окраски реакционной среды, что регистрируется фотометрически.
Следует иметь в виду, что исследуемый материал должен быть оптически прозрачным посуда, в которой производится фотометрирование (в противном случае фотометрирование будет затруднено или вообще невозможно).
Еще сравнительно недавно в лабораториях для биохимических исследований применялись в основном достаточно простые фотометры (типа ФЭК, КФК и т.п.). В последнее время таких инструментов остается все меньше, но до сих пор и они еще встречаются. Измерения сопровождаются вычислениями (иногда довольно трудоемкими). От лаборанта требуется приготовить исследуемый образец, согласно требованиям того набора реагентов, который он собирается использовать, провести биохимическую реакцию, затем произвести фотометрирование, произвести необходимые расчеты и получить результат.
Следующим шагом в развитии приборного оснащения являются программируемые фотометры (приборы типа Stat Fax). Используя эти инструменты, заранее их запрограммировав на достаточно большое количество методик можно существенно ускорить работу. Однако и эти инструменты не выпадают из цепочки: исследуемая среда → измерительный прибор → результат. От качества пробоподготовки, проведения реакции и чистоты посуды существенно зависит точность результатов.
Автоматические биохимические анализаторы позволяют существенно ускорить и упростить процесс получения конечного результата. В этом инструменте проведение реакции (разведение исследуемого образца и реагента, выдерживание времени реакции) и фотометрирование производится автоматически. Роль лаборанта сводится к правильной пробоподготовке (приготовлению исследуемого материала) и загрузкой на борт прибора исследуемых образцов и реагентов. Однако и здесь есть некоторые подводные камни. Вся работа должна в точности соответствовать заданной методике (алгоритму выполнения приготовления реакционной смеси, регистрации и расчета) и попытки что-либо изменить в методике (обычно это делается с целью экономии либо времени, либо расходных материалов) приводит к негативным последствиям, как в точности измерений, так и работе прибора в целом.
Кроме того, при использовании косвенных методов измерения, следует помнить о том, что в самом принципе косвенного метода заложена определенная погрешность.
Поэтому для каждой методики указывается ее точность и воспроизводимость, что необходимо учитывать. Кроме того, в любом инструменте содержатся узлы (а в автоматах их очень много), которые требуют технического обслуживания (очистка, регулировка, замена изношенных деталей). Если этого не делать, то по мере износа прибора точность измерения будет снижаться, а достоверность измерений может вызывать сомнения. Это возникает вследствие износа дозирующих устройств, загрязнения оптического канала, люфтов подвижных устройств.
Фотометрирование в биохимии служит для определения искомого вещества в исследуемой среде и (или) вычисления его концентрации, либо активности, используя изменение окраски реакционной смеси (либо интенсивности окраски, т.е. ее оптической плотности). Как правило, фотометрирование производится на определенной длине волны, которая подбирается таким образом, чтобы поглощение света для данной реакционной смеси было максимальным.
Рисунок 1. Принципиальная схема фотометрического анализа
Расчет результатов измерений производится в зависимости от типа реакции. В частности здесь будут рассмотрены методы расчета по конечной точке, кинетические, псевдокинетические и их производные. В каждом случае расчеты производятся по коэффициенту (фактору), по одному стандарту, либо по калибровочной зависимости сложного вида (мультистандартная калибровка).
Определение по конечной точке
После смешивания реактива и образца, начинается химическая реакция, которая сопровождается изменением оптической плотности (Abs). По истечении времени инкубации, которое задается в методике, реакция прекращается, и изменение оптической плотности также прекращается. Оптическая плотность становится более-менее постоянной величиной, пропорциональной концентрации искомого вещества. В этот момент и производится измерение оптической плотности.
Рисунок 2.
Остановимся на этом моменте подробнее.
При калибровке по стандарту, выполняется замер оптической плотности реакционной смеси, где концентрация искомого вещества заведомо равна нулю (бланк). Затем, измеряется оптическая плотность реакционной смеси, где концентрация искомого вещества известна с высокой точностью (калибратор или, как еще говорят – стандарт), и химическая реакция подошла к концу (т.е. время инкубации закончилось). Калибратор обычно прилагается к набору реагентов. Допустим, что 250 – это оптическая плотность бланка, 700 – это оптическая плотность стандарта. Получив эти величины, мы можем построить график, где на горизонтальной оси — концентрация, а по вертикальной – оптическая плотность, причем оптическая плотность прямо пропорциональна концентрации.
Factor = сtg a
Рисунок 3.
Получив такой график, который называется калибровочным, измеряя оптические плотности последующих образцов (исследуемых), можно высчитать концентрацию искомого вещества.
При использовании калибровки по стандарту, расчет производится по следующей формуле:
При использовании современных инструментов фотометрирования (специализированных фотометров), концентрация высчитывается автоматически. При этом автоматически высчитывается фактор – пропорциональный углу наклона калибровочного графика по отношению к горизонтали (на самом деле высчитывается тангенс угла наклона).
Еще одна разновидность реакции по конечной точке – расчет по фактору.
В этом случае замеряется оптическая плотность бланка и по уже заданному фактору (который пропорционален углу наклона) производится измерение плотностей исследуемых образцов.
Формула для расчета будет следующей:
Еще одна разновидность конечно-точечной реакции – определение по сложной калибровочной кривой. Такая калибровочная зависимость применяется, когда интенсивность изменения окраски не прямо пропорциональна концентрации искомого вещества. В таких случаях используют несколько стандартов (до 9).
Рисунок 4.
Если говорить о современных методах исследований, то такая калибровка применяется чаще всего в методах иммунохимии.
Кроме всего, следует упомянуть о методах бихроматического фотометрирования. Этот метод является частным случаем метода по конечной точке. Вместо оптической плотности измеренной на одной длине волны, в расчете используется разность оптических плотностей, измеренных на двух длинах волн – основной и вспомогательной (часто в терминологии используется термин – дифференциальный). Такой метод определения используется, когда нужно «отфильтроваться» от помех, обусловленных оптическими свойствами емкости, в которой производится фотометрирование (например, цилиндрическая пробирка), мутностью исследуемого образца (а иногда и окраской).
Еще одним частным случаем метода определения по конечной точке является дифференциальный метод (метод с холостой пробой по образцу). При использовании этого метода на одном и том же исследуемом образце приготавливается две пробы – одна с неполной композицией реагентов (когда не происходит специфическое окрашивание образца), вторая с полной композицией реагентов, когда специфическое окрашивание происходит. Разница оптических плотностей этих двух проб пропорциональна концентрации исследуемого вещества.
Кинетические методы измерения
Кинетические методы измерения – это методы, когда изменения оптической плотности регистрируются во времени и измеряется скорость изменения, которая пропорциональна либо концентрации исследуемого вещества, либо активности этого вещества (например, ферментов).
Ниже показан типичный пример кинетического измерения.
Рисунок 5.
Расчет производится либо по фактору, либо по стандарту.
Активность ферментов обычно вычисляется по фактору:
Расчет с калибровкой по стандарту:
В случае калибровки по стандарту, расчет происходит по той же самой формуле, только здесь фактор не является параметром, заданным в методике на реагенты, а вычисляется по формуле:
Псевдокинетические методы измерения (двухточечная кинетика).
Здесь также определяется скорость изменения оптической плотности по времени реакции, только здесь измеряется оптическая плотность в начале интервала измерения (после ЛАГ-фазы) и в конце.
Источник: unimed.ru